العزل والتوصيف الجزيئي لبكتيريا كزيليلا فستديوزا Xylella fastidiosa مع الإدارة الاستباقية المستدامة، والتحكم البيولوجي باستخدام الببتيدات المضادة للميكروبات.
اطروحة دكتوراة للطالبة كوثر الهندي
تاطير : د. الحسن اشباني و د. مجيدة حافظي و من ايطاليا ذ. توفيق البينو
ملخص
كزيليلا فستديوزا (Xylella fastidiosa) هي بكتيريا نباتية ضمن الحجر الصحي ، تقتصر على نسيج الخشب، وهي تهاجم عددًا كبيرًا من الأنواع النباتية مسببة أعراضًا مختلفة تتطور بشكل تدريجي مؤدية في النهاية إلى تيبس النبات وبالتالي موته. هذه الأعراض هي نتيجة استعمار أنسجة نسيج الخشب بواسطة البكتيريا التي تمنع نقل الماء والعناصر المعدنية في النبات. يمكن أن يسبب المرض تأثيرًا كبيرًا جدًا من وجهة نظر اقتصادية وبيئية ومجتمعية. على الرغم من الجهود البحثية الكبيرة، لم يتم تطوير أي علاج مباشر ولا استراتيجية فعالة لمكافحة الأمراض المرتبطة Xylella.
يهدف هذا البحث إلى: 1) التوصيف الجزيئي للبكتريا Xylella fastidiosa (Xf) subsp. pauca ST53، ii) الإدارة الاستباقية المستدامة، 3) المكافحة البيولوجية البيئية باستخدام الببتيدات المضادة للميكروبات.
تم إجراء التوصيف الجزيئي لـ Xf بعد عزل البكتيريا من النباتات المضيفة المصابة، Olea europaea L. Polygala myrtifolia وRosmarinus officinalis من منطقة بوليا في جنوب إيطاليا.
قبل عزل البكتيريا، تم استخدام RT-LAMP وqPCR لتحديد ما إذا كانت موجودة أم لا في جميع المضيفين. تم استخدام طريقتين للاستخراج: الطباعة واستخراج النسغ. يتم طلاء الخلاصة التي تم الحصول عليها على وسط مخزّن بمستخلص خميرة السيستين (BCYE). اظرت النتائج انه على غرار Olea europaea، Polygala myrtifolia تتمتع أيضا بإمكانية عزل جيدة، وأظهرت طريقة الطباعة نتائج أفضل بشكل ملحوظ.
خضعت عزلتان من Olea europaea L للبصمة باستخدام نظام التسلسل متعدد الضبط البؤري (MLST) لإظهار مواضع وراثية مشتركة مع سلالة De Donno (ST53) وبالتالي تؤكد أن منطقة بوليا لا تزال تحتفظ بنفس النوع من تسلسل ST53. بالإضافة إلى ذلك، ونظراً للتنوع الكبير في المناطق المناخية ل Xf، ومن أجل تقييم مخاطر التأسيس المحتمل داخل بلدان خالية من المرض (حالة المغرب)، تم إجراء دراسات استقصائية في مناطق مختلفة من المغرب، طنجة، بني. ملال ومراكش والرشيدية وأزيلال ومكناس والحوز والغرب وعلى مختلف المحاصيل النباتية ذات القيمة الاقتصادية الكبيرة مثل أشجار اللوز والحمضيات وأشجار الزيتون من أجل الكشف عن وجود Xf.
لم تكن هناك عينة إيجابية في المناطق التي شملها المسح، مما يؤكد أن المغرب – حتى اليوم – لا يزال أرضًا خالية من هذه البكتيريا.
نظرًا للموقع الجغرافي الهش والمناخ الملائم للمغرب، التجارة ووجود ناقلات محتملة لـ Xf، ولإدارة استباقية ومستدامة لبكتيريا Xf، فمن الضروري فهم آليات استجابة النبات المضيف للبكتيريا. تحقيقا لهذه الغاية، تم إجراء تقييم للمحتوى في أوراق الزيتون من العناصر الأيونية الكلية والصغرى بشكل رئيسي: Ca وCu وFe وMg وMn وNa وZn وP بالإضافة إلى مركبات الفينول والفلافونويد لوضع فرضيات تتعلق بالمقاومة أو قابلية أشجار الزيتون المغربية للإصابة بـ Xf.. كشفت دراستنا أن أصناف “Arbozana” و “Arbiquina” و “Menara” و “Haouzia” يمكن أن تتحمل عدوىXf بدرجات مختلفة في ضوء محتواها على قيم عالية من المنغنيز (30 مجم / كجم) والنحاس ( 17 جم / كجم)، مركبات الفينول (16 مجم GAE / جم)، الفلافونويد (13 مجم GAE / جم) وقيم منخفضة من الكالسيوم (13 جم / كجم). وتوفير دعم إضافي للتفاعل المرضي من الصنف المقاوم “Leccino” والنوعين المعرضين للإصابة “Ogliarola salentina” و “Cellina di Nardö”.
حتى الآن، لم يتم تطوير أي استراتيجية فعالة لمكافحة المرض وعلاج الأعراض المصاحبة لXf. لا تزال هناك حاجة إلى مركبات دفاع رئيسية ذات آليات عمل عالية الكفاءة ويمكن أن تكون مفيدة جدًا في مكافحة هذا العامل الممرض، ومن ثم الهدف تسليط الضوء من خلال الاختبارات في المختبر وفي الجسم الحي. للنشاط الحيوي لـ 9 ببتيدات مضادة للميكروبات (Ascaphin -8 ، Piscidin 1 ، BP178 ، DASamP1 ، DASamP2 ، Maculatin 1.3 ، Lycotoxin I ، 1036 و RIJK2) ضد Xf كما ورد في الأدبيات لتكون فعالة ضد البكتيريا البشرية والحيوانية ، مثل Escherichia coli ، Staphylococcus aureus و Pseudomonas aeruginosa ، ، أظهرت نتائج تحليلات الـ PCR الكمي (v-qPCR) ، والفحص المجهري الفلوري (FM) ، والكثافة البصرية (OD) ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) أن الببتيدات Ascaphin-8 و DASamP1 و DASamP2 أظهرت نسبة عالية جدًا من مبيدات الجراثيم و خصائص مضادة للبيوفيلم تتمتع بفاعلية أكبر من الببتيد PB178 ، الذي تم الإبلاغ عنه حاليًا كواحد من أقوى الببتيدات المضادة للميكروبات ضدXf. بالإضافة إلى ذلك، عند اختبارها على الخلايا حقيقية النواة، أظهرت هذه الببتيدات المضادة للميكروبات ذات سمية منخفضة أو منعدمة
. في اختبارات النبات، لم تُلاحظ أي أعراض في نباتات Nicotiana tabacum المعالجة بالببتيدات المضادة للميكروبات بعد 40 يومًا من التلقيح، مما يؤكد نشاطها المضاد القوي، والذي يمكن أن يساهم في تطوير حلول واعدة وصديقة للبيئة في إدارة الأمراض المرتبطة بـ Xf
الكلمات المفتاحية: Xylella fastidiosa MLST ، الإدارة الاستباقية ، AMPs ، المكافحة الحيوية ، الببتيدات المضادة للميكروبات ، الإدارة المستدامة.
“ Isolation And Molecular Characterization of Xylella fastidiosa with Proactive Sustainable Management, and Biocontrol Using Antimicrobial Peptides “
Abstract
Xylella fastidiosa is a xylem-limited quarantine plant bacterium, it attacks a large number of plant species causing various symptoms ranging from chlorosis to plant dieback. These symptoms are the consequence of the colonization of xylem tissues by the bacterium, blocking the transport of water and mineral elements in the plant. The disease can cause a very significant impact from an economic, environmental and social point of view. Despite significant research efforts, neither a direct treatment nor an efficient strategy has yet been developed for combatting Xylella-associated diseases.
The objectives of this thesis work are i) Molecular characterization of Xylella fastidiosa (Xf) subsp. pauca ST53, ii) Proactive sustainable management, and iii) Ecological biocontrol using antimicrobial peptides.
Molecular characterization of Xf was carried out following pure culture isolation of the bacterium from naturally infected host plants showing symptoms related to Xf, Olea europaea L. Polygala myrtifolia and Rosmarinus officinalis collected in the region of Puglia in southern Italy. Prior to the isolation of the bacterium by two extraction methods which were printing and sap extraction, molecular DNA amplification techniques, RT-LAMP and qPCR were used to determine the presence or absence of bacteria in all hosts.
Pure bacterial cultures were obtained from both Olea europaea L. and Polygala myrtifolia extracts plated in buffered cysteine-yeast extract (BCYE) media. Besides Olea europaea, Polygala myrtifolia seems to have a good potential for isolation, and the printing method has presented significantly better results. Two olive isolates were subsequently typed using the Multilocus Sequencing Typing (MLST) showing genetic commonality with De Donno (ST53) strain and ascertaining that the Apulia region still has the same sequence type ST53.
In addition, and due to the great diversity of climatic zones of Xf and in order to evaluate the risk of potential establishment within countries free of the disease, herein the case of Morocco, surveys were carried out in different regions of Morocco, Tangier, Beni Mellal, Marrakech, Errachidia, Azilal, Meknes, Haouz and Gharb and on different plant crops of high economic value such as almonds, citrus and olives, with the aim of detecting the presence of Xf.
Results did not show any positive sample in the investigated areas, confirming that Morocco – up this day – still remains a territory free of this bacterium.
Due to the vulnerable geographical position and climate of Morocco, trade and the presence of potential vectors of Xf, and for a proactive and sustainable management of Xf, it is considered necessary to understand the host plant’s response mechanisms to Xf. To this end, an assessment of macro and microelements content mainly: Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, Na, Zn and P in olive leaves as well as phenolic and flavonoids compounds were carried out to develop hypotheses related to a possible resistance or susceptibility of the Moroccan olive trees to Xf infection. Our study revealed that the varieties ‘Arbozana’, ‘Arbiquina’, ‘Menara’ and ‘Haouzia’ could tolerate Xf infection to varying degrees containing high values of Mn (30 mg/kg), Cu (17 g/kg), phenolic compounds (16 mg GAE/g), flavonoids (13 mg GAE/g) and low values in Ca (13g/kg). Thus, providing additional support for the disease response of the resistant variety ‘Leccino’ and the two susceptible varieties ‘Ogliarola salentina’ and ‘Cellina di Nardö’.
To date, neither a direct treatment nor an efficient strategy has yet been developed for combatting Xylella-associated diseases. Defense compounds with highly effective mechanisms of action that could be of much value to combat this vector-borne pathogen are still needed. Thus, we disclose the bioactivity of 9 AMPs (i.e, Ascaphin-8, Piscidin 1, BP178, DASamP1, DASamP2, Maculatin 1. 3, Lycotoxin I, 1036 and RIJK2), reported in the literature to be efficient on human and animal bacteria, i.e., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Pseudomonas aeruginosa, against Xf, through in-vitro and in-vivo experiments. Based on Viable-quantitative PCR (v-qPCR), fluorescence microscopy (FM), optical density (OD), and transmission electron microscopy (TEM) assays, peptides Ascaphin-8, DASamP1 and DASamP2 showed to have the highest bactericidal and antibiofilm activities, and being more efficient than the peptide PB178, reported as one of 3 the most potent AMPs against Xf at present. Furthermore, these AMPs showed low to no toxicity when tested on eukaryotic cells. In the in-planta tests, no Xf disease symptoms were noticed in Nicotiana tabacum plants treated with the AMPs, 40 days post-inoculation. These results highlighted the high antagonistic activity of tested AMPs, Ascaphin-8, DASamP1, and DASamP2 candidates against Xf that could lead to the development of promising eco-managing Xf related diseases.
Keywords: Xylella fastidiosa, MLST, proactive management, AMPs, biocontrol, antimicrobial peptides, sustainable management.
